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基于宏基因组学的病毒感染检测及鉴定方法
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申请号:201510583787.3 申请日:2015-09-14
CN201510583787
CN105112569B
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摘要:本发明提供一种基于宏基因组学的病毒感染检测鉴定技术。基于宏基因组学的病毒感染检测鉴定技术包括以下四个部分:样本制备、高通量测序、生物信息学分析、结果复核。样本制备过程根据基于宏基因组学的病毒感染检测技术的要求和不同类型检测样本的特点从检测样本中有效提取或富集病毒核酸并建成可供二代测序仪使用的核酸库;高通量测序对样本制备步骤提供的核酸库进行测序以获得充分的高质量的核酸序列信息;生物信息学分析通过对高通量测序提供的大量、高质量核酸序列进行分析进而获得样本核酸提示的病毒组成信息;结果复核部分综合生物信息分析结果和其他信息如技术对照等进行全面研判,最终确定备选的感染病毒,并利用其他技术如PCR进行复核。
Abstract:
申请人: 中国医学科学院病原生物学研究所
Applicant:
地址: 北京市大兴区北京市********(隐藏)
发明(设计)人: 金奇 任仙文 杨剑 胡永峰 杨帆
Inventor:
主分类号: C12Q1/70(2006.01)I
分类号: C12Q1/70(2006.01)I C12Q1/68(2006.01)I
  • 法律状态
2017-11-21  授权
2015-12-30  实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/70申请日:20150914
2015-12-02  公开
注:本法律状态信息仅供参考,即时准确的法律状态信息须到国家知识产权局办理专利登记簿副本。
  • 其他信息
主权项  1.一种基于宏基因组学的病毒检测方法,该方法用于非诊断目的,其特征在于,所述方 法包括以下步骤:
(1)样本制备:基于微量、痕量待检测样本富集、提取病毒核酸构建可用于高通量测序 的核酸库;
(2)高通量测序:设定辅助基于宏基因组学技术的病毒感染检测的内参、对照;
(3)生物信息学分析:本系统的主体部分,从高通量测序数据中准确分析样本中的物种 组成,包括远缘未知的病毒组成;
(4)结果复核:综合多方面信息,对生物信息学分析结果就行遴选、复核;
其中,步骤(1)所述样本制备包括以下八个步骤:病毒灭活、样本定量、病毒纯化、背景 消除、提取核酸、合成cDNA、等比扩增、核酸纯化;
1)病毒灭活:样本要根据疑似病毒的种类和样本的特点采取通用的或特异的病毒灭活 方法进行灭活;
2)样本定量:对样本总量、样本所含病毒载量、病毒核酸量进行初步测定和估计,从而 为后续实验步骤制定详细计划;
3)病毒纯化:通过超速离心将病毒颗粒进行富集纯化,从而提高病毒序列在最后结果 中所占的比例;
4)背景消除:在提取病毒核酸前将宿主的DNA和RNA利用DNA酶和RNA酶进行充分消化;
5)提取核酸:提取病毒核酸,主要提取病毒的核糖核酸;
6)合成cDNA,将第五步提取出来的病毒核糖核酸转化成更稳定更易保存的cDNA;
7)是可选步骤,如果第六步获得的cDNA量足够进行高通量测序,则直接进入高通量测 序环节,如果不能达到高通量测序的要求,则进行第七步的基于PCR的核酸序列等比扩增直 至满足高通量测序对上样量的要求;
8)纯化第六步或第七步获得的病毒核酸用于后续的高通量测序;
其中,步骤(2)所述高通量测序,方法如下:取DNA样本,利用超声随机打断,末端补平后 连接测序用adapter,胶回收300-350 bp片段;PCR扩增后使用Illumina Cluster Generation试剂盒构建高通量测序文库;加入事先制备好的内参核酸;应用Illumina/ HiSeq2500测序仪进行深度测序,为避免可能的交叉污染,待检测样本和对照样本分别使用 单一甬道进行深度测序,片段读长80 bp;
其中,步骤(3)所述生物信息学分析,方法如下:
使用CASAVA软件包将测序信号数据转换为FASTQ格式的序列数据用于后续的生物信息 学分析;运行MetaReadsQC软件包,去除由CASAVA软件标记为“Y”的序列,去除中间含有“N” 的序列,去除平均分值低于20的序列,剪掉序列末尾分值连续低于20的序列,去掉引物序 列,用软件DUSTMASKER去掉低复杂度序列,去掉完全相同或反向互补的序列,去掉小于50bp 的短序列,用BFC、BLESS或BLUE软件采用默认参数对序列进行纠错校正;利用Bowtie2、BWA、 SNAP和SMALT软件将上一步获得的序列快速映射都宿主核酸数据库上,将不能映射的序列 保存作后续分析;在核酸水平利用软件MetaVelvet对由上一步获得的不能映射到宿主核酸 序列上的序列进行拼接,在蛋白水平利用软件MetaQridge进行拼接;将上述步骤获得的拼 接序列和原始核酸序列与事先由软件MetaDBConstructor准备好的病毒核酸库、病毒蛋白 库进行比对,由NCBI的BLAST软件包进行,采用参数“-e 1e-5 -F F -b 100 -v 100”;利用 软件MEGAN将BLAST的结果转换成物种组成信息,单一病毒最少5条reads支持,不能映射成 具体病毒种的序列由软件MetaTaxAssigner根据比对的分数高低、位置、对序列的覆盖率信 息求几何平均数单独进行分析;根据序列的物种映射信息、物种基因组大小以及比对情况、 内参数据和对照数据,由软件MetaTaxQuantifier对物种组成的概率、丰度进行推算,获得 样本的物种组成定量分析表。
公开号  105112569B
公开日  2017-11-21
专利代理机构  北京华科联合专利事务所(普通合伙) 11130
代理人  王为 孟旭
颁证日  
优先权  
 
国别 优先权号 优先权日 类型
CN  201510583787  20150914 
国际申请  
国际公布  
进入国家日期  
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